Research and application of single-cell RNA-sequencing technology in articular cartilage of osteoarthritis

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-134X.2024.03.009

Abstract

Abstract:

The etiology and pathogenesis of osteoarthritis (OA) remain unclear and the main pathological changes are cartilage degeneration, synovial inflammation and subchondral bone remodeling. Currently, research on the mechanism of OA still has many limitations and inaccuracies, such as ignoring the significance of individual cell heterogeneity in the development of OA. Bulk RNA sequencing obtains the average gene expression level of all cell populations or a group of cell populations in the tissue and average transcriptome data. Single cell RNA-seq (scRNA-seq) obtains the gene expression level of individual cell. It plays an important role in discovering cellular heterogeneity and transcriptome analysis of trace samples, and provides new strategies for understanding the pathological mechanisms of OA at the molecular level and discovering potential therapeutic targets. This article summarized the core steps of scRNA-seq technology and its research and application in articular cartilage of OA.

Key words: Single-cell analysis, Sequence analysis, RNA, Osteoarthritis, Cartilage, articular

Song Chen, Lingqiao Huang, Qingqing Yu, Zhixin Wei, Yan Fu. Research and application of single-cell RNA-sequencing technology in articular cartilage of osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Joint Surgery(Electronic Edition), 2024, 18(03): 363-371.

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Figures/Tables 8

References 58

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单细胞分离技术	技术简介	优势	不足
连续稀释法^{［9, 42］}	通过连续稀释细胞群来获得单个细胞	操作简单、重复性强，且成本低	易造成DNA污染
显微操作法^{［9, 43］}	根据目测的细胞形态特征及染色特性来手动分选细胞	技术成本低，可视化操作，且适用于悬浮细胞	易出现细胞识别错误和造成细胞损伤，且通量低、人力成本高
LCM^{［9, 44-45］}	在确认需要操作的细胞后，激光切除标记区细胞	可行活组织的细胞提取，也可从固定样本中获取细胞	切割精度有限，容易混杂相邻细胞成分，且容易破坏细胞的完整性
FACS^{［9, 46］}	特异性荧光标记的抗体或染料与细胞结合，激发出荧光信号，信号强度与细胞表面荧光标记的分子表达水平相关，实现对细胞快速、准确的分选	具有很高的精度和通量，且能够筛选出异质性细胞群中的罕见细胞	样本需求量大，低丰度和低荧光标记细胞分选困难，且容易造成细胞损伤
MACS^［47］	原理类似 FACS，是将磁珠标记的特异性抗体与细胞表面特异性抗原相结合，在外加磁场中实现对细胞的分选	类似FACS，但对设备需求更少，且检测时间更短	类似FACS
微流控技术^{［9, 48-49］}	分为液滴式和芯片式微流控，核心是直径可调、只容许单个细胞通过的通道	控制精确、样本及试剂需求少、分辨率和灵敏度高	成本较高

单细胞分离技术	技术简介	优势	不足
连续稀释法^{［9, 42］}	通过连续稀释细胞群来获得单个细胞	操作简单、重复性强，且成本低	易造成DNA污染
显微操作法^{［9, 43］}	根据目测的细胞形态特征及染色特性来手动分选细胞	技术成本低，可视化操作，且适用于悬浮细胞	易出现细胞识别错误和造成细胞损伤，且通量低、人力成本高
LCM^{［9, 44-45］}	在确认需要操作的细胞后，激光切除标记区细胞	可行活组织的细胞提取，也可从固定样本中获取细胞	切割精度有限，容易混杂相邻细胞成分，且容易破坏细胞的完整性
FACS^{［9, 46］}	特异性荧光标记的抗体或染料与细胞结合，激发出荧光信号，信号强度与细胞表面荧光标记的分子表达水平相关，实现对细胞快速、准确的分选	具有很高的精度和通量，且能够筛选出异质性细胞群中的罕见细胞	样本需求量大，低丰度和低荧光标记细胞分选困难，且容易造成细胞损伤
MACS^［47］	原理类似 FACS，是将磁珠标记的特异性抗体与细胞表面特异性抗原相结合，在外加磁场中实现对细胞的分选	类似FACS，但对设备需求更少，且检测时间更短	类似FACS
微流控技术^{［9, 48-49］}	分为液滴式和芯片式微流控，核心是直径可调、只容许单个细胞通过的通道	控制精确、样本及试剂需求少、分辨率和灵敏度高	成本较高

单细胞转录组测序技术	技术简介	优势	不足
SMART-seq^［50］	首先将全部RNA逆转录成cDNA，然后进行PCR扩增，再将扩增后的cDNA切割成片段，用于构建测序文库	可检测mRNA 全长，且能进行转录本异构体的分析，可以提高转录本的覆盖率	灵敏度不高，制作成本高、周期长
SMART-seq2^［6］	类似SMART-seq	灵敏度更高，扩增偏倚更低	会有部分信息丢失
SUPeR-seq^［51］	基于均聚物尾端PCR的scRNA-seq方法，使用具有固定锚点序列的随机引物代替常用的oligo-dT引物进行cDNA合成	能够在单个细胞内检测poly(A)(+)/(-)的RNA，最大程度减少对rRNA的污染，且灵敏度和基因检测能力都更高	细胞分离过程耗时，通量低
Quartz-seq^［52］	采用抑制性 PCR 的策略使引物自杂交形成平底锅结构来降低副产物，将小片段第二链 cDNA 形成发卡结构	极大降低 PCR 副产物	易造成扩增偏倚
CEL-seq^［53］	利用体外线性（IVT）代替PCR实现扩增。利用含有独特条形码的oligo-dT序列将单细胞RNA逆转录成合成cDNA，通过IVT扩增获得足够的cDNA 构建测序文库	降低样本间的污染和读长偏好	存在扩增偏倚，时间和成本较高
MARS-seq^{［50, 54］}	首先通过FACS分选细胞，识别不同组织和疾病的独特细胞类型，再利用3′末端计数mRNA测序方法生成cDNA	操作偏倚较少，可实现cDNA扩增的多重检测，步骤简单，通量高	时间和成本较高
STRT-seq^［55］	将分子标记与微流控技术相结合，可定量估计起始 mRNA 的表达	减少扩增偏倚，重复性和灵敏度更高，且节约时间和成本	扩增存在序列偏好，会有信息的丢失
SCRB-seq/mcSCRB-seq^［56］	与Smart-seq 步骤大致相同，但它使用的oligo-dT引物中包含具有细胞特异性的条形码和UMI	可以降低cDNA扩增偏差，且操作简单和成本较低	灵敏度不高，会有部分信息丢失
Drop-seq/inDrop^［57-58］	利用微流控技术，将带有UMI的oligo-dT引物和细胞一起装入微小的液滴，细胞裂解后的mRNA与引物结合，在各单管中平行进行反转录、PCR扩增，最后生成测序文库	通量更高、速度更快，且成本更低	需要微流控平台，且会有少量信息的丢失

单细胞转录组测序技术	技术简介	优势	不足
SMART-seq^［50］	首先将全部RNA逆转录成cDNA，然后进行PCR扩增，再将扩增后的cDNA切割成片段，用于构建测序文库	可检测mRNA 全长，且能进行转录本异构体的分析，可以提高转录本的覆盖率	灵敏度不高，制作成本高、周期长
SMART-seq2^［6］	类似SMART-seq	灵敏度更高，扩增偏倚更低	会有部分信息丢失
SUPeR-seq^［51］	基于均聚物尾端PCR的scRNA-seq方法，使用具有固定锚点序列的随机引物代替常用的oligo-dT引物进行cDNA合成	能够在单个细胞内检测poly(A)(+)/(-)的RNA，最大程度减少对rRNA的污染，且灵敏度和基因检测能力都更高	细胞分离过程耗时，通量低
Quartz-seq^［52］	采用抑制性 PCR 的策略使引物自杂交形成平底锅结构来降低副产物，将小片段第二链 cDNA 形成发卡结构	极大降低 PCR 副产物	易造成扩增偏倚
CEL-seq^［53］	利用体外线性（IVT）代替PCR实现扩增。利用含有独特条形码的oligo-dT序列将单细胞RNA逆转录成合成cDNA，通过IVT扩增获得足够的cDNA 构建测序文库	降低样本间的污染和读长偏好	存在扩增偏倚，时间和成本较高
MARS-seq^{［50, 54］}	首先通过FACS分选细胞，识别不同组织和疾病的独特细胞类型，再利用3′末端计数mRNA测序方法生成cDNA	操作偏倚较少，可实现cDNA扩增的多重检测，步骤简单，通量高	时间和成本较高
STRT-seq^［55］	将分子标记与微流控技术相结合，可定量估计起始 mRNA 的表达	减少扩增偏倚，重复性和灵敏度更高，且节约时间和成本	扩增存在序列偏好，会有信息的丢失
SCRB-seq/mcSCRB-seq^［56］	与Smart-seq 步骤大致相同，但它使用的oligo-dT引物中包含具有细胞特异性的条形码和UMI	可以降低cDNA扩增偏差，且操作简单和成本较低	灵敏度不高，会有部分信息丢失
Drop-seq/inDrop^［57-58］	利用微流控技术，将带有UMI的oligo-dT引物和细胞一起装入微小的液滴，细胞裂解后的mRNA与引物结合，在各单管中平行进行反转录、PCR扩增，最后生成测序文库	通量更高、速度更快，且成本更低	需要微流控平台，且会有少量信息的丢失

软骨细胞亚型	高表达基因	功能作用
ECs^{［18,19,20］}	C2orf82、CLEC3A、CYTL1	细胞能量供应；参与软骨的形成和OA的发生、发展
RegCs^［23］	CHI3L1、CHI3L2、CRTAC1	参与信号通路和免疫应答调节
HomCs^{［26, 32］}	MMP3、FOSB、JUN PER1、SIRT1	调节关节软骨昼夜节律
FCs^{［17, 32］}	COL1A1、COL1A2、S100A4、PRG4	促进软骨纤维化和血管形成
ProCs^{［27-28, 38］}	HMGB2、CDK1	防止软骨细胞肥大分化，可向HTCs转变
preHTCs^［29］	COL2A1、COL10A1、IBSP	调节软骨细胞肥大分化
HTCs^［31-32］	COL10A1、IBSP、JUN	促使软骨细胞凋亡和钙沉积
RepCs^［32］	CILP、COL2A1、COL3A1、COMP	修复软骨损伤
preFCs^［32］	IL11、COL1A1、COL2A1、CILP、OGN	与FCs类似，促进软骨纤维化和血管形成
CPCs^［33-34］	BIRC5、CENPU、UNE2C、DHFR、STMN1	修复软骨损伤

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